燃える雑記置き場
随分とブログから遠ざかっておりまして、閉鎖も念頭に入れてはいますが…いくつかのメモは残しておきたいところなので、もうしばらくお目見汚しを。
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多くの木本性植物は葉に多糖類やポリフェノール類を多く含む。そこで、DNA単離の阻害となるこれらを取り除く必要がある。

1. 試料を液体窒素下で粉砕する

2. 試料の10倍量の、β-mercaptoethanol(0.5%)を含む氷冷したIsolation buffer(IB)を加える

3. よく撹拌した後、遠心分離(11,000/4℃/10min)を行い、上清を除く

4. この操作を、上清の粘性がなくなるまで繰り返す

5. 試料の5倍量のLysis buffrer(LB)を加え、よく撹拌する

6. 液量の1/10倍量の10% sarcosineを加え、室温に10分間放置する

7. 等量の2×CTABを加え、室温でインキュベートする

8. 等量のクロロホルム/イソアミルを加え、ゆっくり撹拌する

9. 遠心分離(15,000/室温/10min)

10. 水層を回収し、等量のイソプロパノールを加えてゆっくり撹拌する

11. 核酸の沈殿を回収する(沈殿が少量の場合は、遠心分離6,000/4℃/5minにより回収する)

12. 4~6mlほどのTEに完全に溶解する

13. 1 mlあたり1?のRNaseを加え、37℃で15分反応させる

14. 等量のTE溶フェノールを加え、5分間撹拌する

15. 遠心分離(8,000/4℃/5min)を行い、水層を回収する

16. 14,15の操作を、変性タンパク質の相がなくなるまで繰り返す

17. 等量のクロロホルム/フェノールを加え、5分間撹拌する

18. 遠心分離(8,000/4℃/5min)の後、水層を回収する

19. 3/4倍量のイソプロパノールを加え、ゆっくりと撹拌する

20. DNAの沈殿を、チップの先などを使い回収する

21. 70%エタノールでリンスする

22. 減圧乾燥させた後、滅菌水に溶かす




参考文献
  Bousquet, J., L. Simon and M. Lalonde 1990. DNA amplification from vegetative and sexal tissues of trees using polymerase chain reaction. Can. J. For. Res. 20: 254-257
  向井譲 山本直樹. 1995. 木本植物のDNA・RNA単離法「植物のPCR実験プロトコール 遺伝子の単離・発現からゲノム解析まで」島本功 佐々木卓治 監修. 秀潤社 :54-58.
  Murray, G.C. and Thompson, W.F. 1980. Rapid isolation of hight molecular weight DNA. Nucl. Acid Res. 8: 4321-4325
  Wagnar, D.B., Furnier, G.R., Saghai, M. A. et al. 1987. Chloroplast DNA polymorphism in lodgepole and jack pines and their hybrids. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2097-2100

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DNA抽出に用いる試薬の組成
2005/07/20(水) 21:07:23 | 燃海HP ver.?
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