燃える雑記置き場
随分とブログから遠ざかっておりまして、閉鎖も念頭に入れてはいますが…いくつかのメモは残しておきたいところなので、もうしばらくお目見汚しを。
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実に3年ぶり?にAFLPを。

で、シーケンサーで流してみると(?_?ゞ
うまくいってない…

あぁ、これがいわゆる3年のブランクのせいなんだろうか。
いや、それとも以前の静岡から、岐阜に移ったことによる、何らかの環境変化のせいか?(岐阜に移ってから当研究室は誰もAFLPやっていないor成功していないと言うべきか?)
いやまてよ…
キットのせいも考えられる。
以前はselective amplicationには別に発注したプライマーを用いていたが、今回はキットに付属のプライマー及びPCR bufferを用いた。そのせい??(プライマーの分量やバッファー、Taqとの相性などなど)

QsAFLP_test_060603.jpg 汚い画像でゴメン。各レーンの説明は省略!

今回の泳動像は、同じプライマー対を用いた以前の泳動と比べ、かなり薄い。一方、増幅されたバンドのうちいくつかは、前回増幅された共通バンドとほぼ同じ長さが得られており、pre-selective ampまではやはり成功しているんだろうな~。

只今ゲルの重合待ち。
さて、Taqの量や種類を変えて、もう少し試行錯誤。
下の写真のような過去の栄光を再びっ!!

E-ACA-M-CTA-1.jpg 修論の時のAFLPデータ。
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コメント
この記事へのコメント
追記
今日も失敗・・・(T_T)
もしや、サーマルサイクラーの問題??昨日の反応後、4℃soakの温度が下がりきらず、6度台やった。。。 あら、サイクリング中は大丈夫だったんかい?
毎回この時期にPCRうまくいってない気がする。う~ん、恐怖の夏が始まったか…
2006/06/06
(火) 21:55:46 | URL | 燃海 #LfSnBEJ6[ 編集]
AFLPぐわ
初めまして。植物系の学生やっているものです。現在AFLPを始めた所なんですが、予備実験が上手く行かずに困っています。そんなこんなでネットでAFLPについて調べていたらここに行き着いたわけでして。digラベルで検出しているのですが、大体のバンドパターンは一致するもののバンドが薄い、あるいは出るはずのバンドが出ないというblog中の現象と似た現象に見舞われています。ただ制限酵素処理段階での問題か、preーamp以降のPCRでの問題だか判じかねています。鶴田さんは制限酵素処理が上手く行っているかどうかどのように判断されていますか?もし宜しければご教授下さい。
2008/01/02
(水) 14:46:37 | URL | ドンでんねん #-[ 編集]
>ドンでんねんさんへ
残念ながら、どのようなKitを使用されているかおぼろげにしか想像できないため、正確なアドバイスはいたしかねますが…

どの段階で差が生じているのかを押さえたいだけでしたら、同じサンプルを用い、片や酵素処理をプロトコル通り、片やプロトコル+1 hour処理し、その後同じように実験を進め、泳道像がどれほど変るかを確認するのも手だと思います。
さして代わりが無いようでしたら、別の場所に問題を探すべきかも知れませんし、大きく異なるようでしたら、酵素処理が足りなかったなどと判断すべきかもしれません。また、サンプルによって結果が大きく異なるようでしたら、それ以前、DNAの質を疑った方がいいのかもしれません。
どのようなサンプルを用いられているか知りませんが、植物体によっては抽出の段階で上手くDNAが単離できず、その後の反応に大きく影響されることがあります。私は樹木の葉から抽出したDNAを用いていましたが、精製の際取り除けなかったポリフェノールが、酵素反応を邪魔するといった経験が多くあります。

また、増幅反応において、どのようなTaqを使用するかによって、結果が大きく変ることも私の経験ではありました。なるべく安定性のあるTaqの使用を勧めますが…一度別のTaqを用いて増幅してみるのも手かと。
それで上手くいけば、ばんばんざい。上述のような酵素反応からやり直す手間は省けますが。
まぁ、結局、色々あがいてみろといったとこです。はい。

今できるアドバイスとしては、こんなもんでしょうか?不明な点がありましたら、またお聞きください。微力ながら、お手伝いいたします。

年度末に向け、データをしっかり集めなければならない時期かと思います。ドンでんねんさんもがんばってください。
2008/01/02
(水) 16:47:28 | URL | 燃海 #fBVKm68U[ 編集]
参考になります
ありがとうございます。kitはinvitrogenのものを使っているのですが、酵素が切れているので制限酵素はタカラのEco R1とNEBのMSE1で代用しています。酵素反応は長くした方が良いだろうと思いプロトコールの倍ほどover nightで放置しています。反応時間が長過ぎておかしくなったことは有りますか?taqはタカラのr taq使ってますが他のものでも試してみることにします。では頑張ってみます。
2008/01/02
(水) 18:34:04 | URL | どんでんねん #-[ 編集]
>ドンでんねんさんへ
重要!!!

制限酵素がKitと他社のものというのはさほど気になりませんが…
オーバーナイトで反応させているというのは問題あるかと思われます。詳しくは『スター活性』を、調べてみてください。完全に消化したいという気持ちはよく分かりますよ。

確か、invitrogenのプロトコルでは反応時間2時間ほどでは??私もそれを推奨します。Digラベルのは違うのかな?
2008/01/02
(水) 21:55:49 | URL | 燃海 #fBVKm68U[ 編集]
スター活性
濃度とかだけやなくて処理時間も関係するのですね。助言の方ありがとうございます。プロトコル通りの処理時間でやってみます。
2008/01/03
(木) 01:29:38 | URL | どんでんねん #-[ 編集]
何とかかんとか
色々雑務が重なって中々実験出来なかったのですが約1月かかってようやくAFLPの問題が解決出来ました。色々しまして何とかかんとか。Taqも含め色々試みすぎて何が原因だったのか判然としなくなってしまったのですが、ご助言の方本当にありがとうございました。やっとスタートラインですがこれからバリバリやっていきます。
2008/01/19
(土) 10:04:52 | URL | どんでんねん #-[ 編集]
>どんでんでんさんへ
さほどお力にはなれませんでしたが…(^^ゞ 原因はともかく、うまくいったようで一安心ですね。
実験結果も、面白いものが出るといいですね。学会でAFLPを用いた研究があったら、どんでんねんさんかなぁ~?などと妄想して楽しむことにします。笑
あ、森林学会じゃなければ、ご安心を。
2008/01/24
(木) 21:24:39 | URL | 燃海 #fBVKm68U[ 編集]
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ふふふっ(☆_-)vはっはっはっはっ!!おめでとぉーー☆ぼくぅ!!色々と試行錯誤の上、ついにこんな結果を出すことが出来た!! 本日のAFLPの泳動像(まだ途中だけど)DNAのバーコー
2006/06/11(日) 00:29:29 | 燃海HP ver.III
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