燃える雑記置き場
随分とブログから遠ざかっておりまして、閉鎖も念頭に入れてはいますが…いくつかのメモは残しておきたいところなので、もうしばらくお目見汚しを。
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えぇ~~~~。
14:00までって、メールには書いてあったじゃん!!
大会事務局さまぁ~。
まだログインできます。

やはり、そのメールの表記に気が付かず、今日の日付が変わるギリギリまでが期限と思っている人が多いってこと?(私も昨日まで、そう信じていた。今日は先ほどまでいっぱいいっぱいでした)

なんだ。また手直し加え、アップロードし直そう。

あ、集中力は切れてしまったので、そのままかも?

とりあえず、追記に要旨の内容をアップしておきます。
PDFがブログにアップできたらいいのに・・・



M08
「SSRマーカーを用いた受精した胚の分析によるコナラの配偶子間競争の同定」
○鶴田燃海・向井譲(岐阜大)

はじめに
 分子マーカーは、繁殖生態の分野で多くのことを明らかにしつつある。特に多型性の高いSSR マーカーは父性解析に利用され、花粉を介した遺伝子流動の実態の詳細を明らかにしつつある。さらにこれらの分子マーカーはPCRをベースとしているため、微量サンプルからの解析も可能で、例えば花粉一粒からの分析など、成果が大変期待される研究もある。一方で、これらのマーカーは繁殖生理の分野への利用も期待できる。本研究では分子マーカーが樹木における、受粉から受精するまでおよび受精後種子が発達するまでの、配偶者選抜の仕組みを解明する可能性を検証する。花粉管競争などこれらの配偶子間相互作用は、今までの研究では顕微鏡を用いた解剖学的視点でしか見られることは無かった。本研究ではコナラの人工交配を行ない、異なる発達ステージでの堅果、受精した胚珠においてそれぞれの花粉親遺伝子型の組成を調べることにより、受粉から受精まで、受精後の選抜の有無を明らかにする。

材料と方法
 2000年、2005年春に、Selfを含む5個体(P19, P20, P50, P63 and P87)の花粉を等量ずつ混ぜ合わせた混合花粉を用い、人工交雑を行った。2000年の交配により発達した堅果を採取し、播種、実生よりDNAを抽出し、SSR分析により父親を決定した。2005年の交配では受精後の胚珠において解析を行った。コナラは受粉後11~12週に、子房内にある6つの胚珠のうち一つが子房全体を占めるようになる(T. Kanazashi and A. Kanazashi 2002)。この時期の直前に堅果を採取し、双眼実態顕微鏡視野下でメス、柄付き棒を用いて、子房内からそれぞれの胚珠(おおよそ0.5×0.3mm)を取り出した。単離した胚珠はマイクロチューブへ入れ、-20℃で保存した。DNAの抽出にはExtract-N-Amp Plant PCR Kits(SIGMA)を使用した。
 Quercus petraeaにおいて報告されている(Steinkellner et al. 1997)3つのSSRマーカー(QpZAG3/64, QpZAG15, QpZAG110)を用い、父性解析を行った。胚珠からの抽出したDNAにおけるSSR増幅には、一度PCRを行った産物を鋳型に、さらに2回目のPCRを行なった。シーケンサー(Model 4200S 1G; LI-COR)を用いて電気泳動を行い、Saga(LI-COR)によってジェノタイピングした。

結果と考察
 3つのSSRマーカーの対立遺伝子数は平均5で、解析した堅果の花粉親をすべて決定することが出来た。実生の父性解析を行ったところ、等量の花粉を混ぜて受粉させたにも関わらず(交配した日に花粉の発芽試験も行なっているが発芽率に差はほとんどない)、実生の花粉親の割合には大きな差が認められた。解析した種子におけるそれぞれの花粉親が貢献した割合は、最も少ないものでP20で1.16%だったのに対し、P50では16.28%、P63とP87ではそれぞれ43.02%、39.53%と、大きな違いが認められた。またこのとき、自家花粉由来の実生は見られなかった。人工交配の結果とあわせ、このことからも、コナラが強い自家不和合性を持つことが確認された。
 現在、発達段階の胚珠を単離し、そこからのDNA抽出と、SSRマーカー
遺伝子座の増幅まで成功している。今後、採取した全胚珠について解析を進める。ここで同定された花粉親の割合より、同種間の花粉管競争を可視的に表すことが出来る、また種子まで発達したサンプルの花粉親候補の組成と比較することにより、受精後の接合子間の相互作用を明らかにすることが出来ると期待される。

DSCN0133_ed.jpg

Refarence
 Kanazashi, T. and A. Kanazashi. 2003. Estimation for the timing of the internal developmental processes of acornes from fruit size in Quercus serrata Thunb. ex Murray. J For Res 8:261-266.
 Steinkellner et al. 1997. Identification and characterization of (GA/CT)n - microsatellite loci from Quercus petraea. Plant Mol. Biol. 33: 1093-1096.

(連絡先:鶴田 燃海 j6102009@guedu.cc.gifu-u.ac.jp )
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